تکنیک NGS چیست؟ بررسی کامل توالی‌یابی نسل جدید، مراحل، کاربردها و مزایای آن

توالی‌یابی نسل جدید یا Next-Generation Sequencing (NGS) مجموعه‌ای از فناوری‌های پیشرفته برای تعیین توالی DNA و RNA است که امکان بررسی تعداد بسیار زیادی از توالی‌های ژنتیکی را در مدت‌زمان کوتاه فراهم می‌کند. برخلاف روش‌های سنتی مانند Sanger Sequencing، در NGS می‌توان هزاران تا میلیون‌ها قطعه DNA را به‌صورت موازی توالی‌یابی کرد.

امروزه تکنیک ان جی اس در حوزه‌هایی مانند تشخیص بیماری‌های ژنتیکی، تحقیقات سرطان، پزشکی شخصی، ژنومیک، ترنسکریپتومیکس، شناسایی میکروارگانیسم‌ها و تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی کاربرد گسترده‌ای دارد.

در این مقاله با مفهوم NGS، نحوه عملکرد، مراحل انجام آزمایش، انواع روش‌های توالی‌یابی نسل جدید، کاربردها، مزایا و محدودیت‌های آن آشنا می‌شویم.

NGS چیست؟

NGS مخفف Next-Generation Sequencing به معنای «توالی‌یابی نسل جدید» است. این فناوری به مجموعه‌ای از روش‌های توالی‌یابی گفته می‌شود که با استفاده از آن‌ها می‌توان حجم بسیار زیادی از اطلاعات ژنتیکی را به‌صورت هم‌زمان بررسی کرد.

در روش‌های قدیمی توالی‌یابی، معمولاً یک قطعه DNA در هر واکنش مورد بررسی قرار می‌گرفت؛ اما در ان جی اس میلیون‌ها قطعه DNA می‌توانند به‌طور موازی توالی‌یابی شوند. همین قابلیت باعث شده است این تکنیک سرعت و ظرفیت بسیار بالاتری نسبت به روش‌های سنتی داشته باشد.

به زبان ساده، اگر بخواهیم ژنوم را مانند یک کتاب بسیار بزرگ در نظر بگیریم، روش Sanger می‌تواند بخش‌های محدودی از این کتاب را با دقت بالا بخواند؛ در حالی که ان جی اس امکان خواندن تعداد بسیار زیادی از صفحات این کتاب را به‌صورت هم‌زمان فراهم می‌کند.

تفاوت NGS و Sanger Sequencing چیست؟

Sanger Sequencing یکی از روش‌های کلاسیک و بسیار دقیق توالی‌یابی DNA است که هنوز هم در برخی کاربردهای آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

تفاوت اصلی NGS و Sanger در نحوه انجام توالی‌یابی و مقیاس بررسی است.

بنابراین NGS جایگزین مطلق Sanger نیست، بلکه هرکدام بر اساس نوع پروژه و هدف آزمایش می‌توانند کاربرد متفاوتی داشته باشند.

NGS چگونه کار می‌کند؟

اگرچه جزئیات فنی ان جی اس در پلتفرم‌های مختلف متفاوت است، اما روند کلی این فناوری شامل چند مرحله اصلی است:

۱. استخراج DNA یا RNA

اولین مرحله، تهیه نمونه مناسب است.  بسته به نوع آزمایش، DNA یا RNA از نمونه‌هایی مانند خون، بافت، بزاق، سلول، نمونه توموری یا سایر نمونه‌های زیستی استخراج می‌شود.

کیفیت و کمیت ماده ژنتیکی استخراج‌شده اهمیت زیادی دارد؛ زیرا DNA یا RNA نامناسب می‌تواند کیفیت کتابخانه و در نهایت نتایج توالی‌یابی را تحت تأثیر قرار دهد.

۲. آماده‌سازی Library

در مرحله بعد، DNA یا cDNA به قطعات مناسب تبدیل شده و برای توالی‌یابی آماده می‌شود. به مجموعه این قطعات آماده‌شده Sequencing Library گفته می‌شود.

در این مرحله معمولاً توالی‌هایی به نام Adapter به دو طرف قطعات DNA اضافه می‌شوند. آداپتورها برای اتصال قطعات به سطح یا سیستم توالی‌یابی و همچنین انجام برخی مراحل تکثیر و شناسایی نمونه‌ها ضروری هستند.

۳. Amplification

بسته به نوع پلتفرم و پروتکل، ممکن است قطعات DNA برای افزایش سیگنال قابل تشخیص تکثیر شوند.

برای مثال، در برخی فناوری‌ها از روش‌هایی مانند PCR یا تکثیر موضعی برای تولید تعداد زیادی نسخه از قطعه هدف استفاده می‌شود.

۴. Sequencing

در مرحله اصلی، دستگاه ان جی اس اطلاعات مربوط به توالی نوکلئوتیدها را ثبت می‌کند.

بر اساس فناوری مورد استفاده، روش شناسایی بازها متفاوت است. در بسیاری از پلتفرم‌ها، اضافه شدن نوکلئوتیدها یا تغییرات ایجادشده در فرآیند سنتز DNA به‌عنوان سیگنال شناسایی می‌شوند.

نتیجه این مرحله معمولاً مجموعه بزرگی از توالی‌های کوتاه به نام Reads است.

۵. تحلیل بیوانفورماتیکی

یکی از مهم‌ترین مراحل ان جی اس، تحلیل داده‌هاست. خروجی دستگاه به‌تنهایی معمولاً قابل تفسیر مستقیم نیست و باید با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیک پردازش شود.

در این مرحله می‌توان کارهایی مانند:

• کنترل کیفیت Reads
• حذف توالی‌های نامناسب
• Alignment
• Assembly
• شناسایی Variantها
• Annotation
• مقایسه نمونه‌ها
• تحلیل بیان ژن

را انجام داد.

به همین دلیل، NGS تنها یک تکنیک آزمایشگاهی نیست و بیوانفورماتیک بخش جدایی‌ناپذیر بسیاری از پروژه‌های NGS محسوب می‌شود.

مراحل اصلی انجام آزمایش NGS

به‌طور کلی می‌توان فرآیند ان جی اس را به شکل زیر خلاصه کرد:

Sample → DNA/RNA Extraction → Library Preparation → Amplification → Sequencing → Quality Control → Bioinformatics Analysis → Biological Interpretation

البته بسته به نوع پروژه ممکن است برخی مراحل تغییر کنند یا یک مرحله حذف شود.

انواع روش‌های NGS

ان جی اس تنها یک فناوری واحد نیست و پلتفرم‌ها و روش‌های مختلفی برای انجام توالی‌یابی نسل جدید وجود دارد.

Targeted Sequencing

در این روش به جای بررسی کل ژنوم، مجموعه ی مشخصی از ژن‌ها یا نواحی ژنومی مورد مطالعه قرار می‌گیرند.

برای مثال، می‌توان یک پنل ژنی طراحی کرد که تعدادی ژن مرتبط با یک بیماری خاص را بررسی کند.

این روش معمولاً برای پروژه‌هایی که هدف مشخصی دارند، گزینه مناسبی است.

Whole Exome Sequencing یا WES

در Whole Exome Sequencing (WES) بخش‌های کدکننده ژنوم که به آن‌ها Exon گفته می‌شود، مورد بررسی قرار می‌گیرند.

اگرچه اگزوم تنها بخش کوچکی از کل ژنوم را تشکیل می‌دهد، اما بخش قابل توجهی از واریانت‌های مرتبط با بیماری‌ها در نواحی کدکننده شناسایی می‌شوند.

WES به‌خصوص در تحقیقات و بررسی بیماری‌های ژنتیکی با علت نامشخص کاربرد زیادی دارد.

Whole Genome Sequencing یا WGS

در Whole Genome Sequencing (WGS) تقریباً کل ژنوم فرد مورد توالی‌یابی قرار می‌گیرد.

WGS در مقایسه با روش‌های هدفمند اطلاعات بسیار بیشتری تولید می‌کند و می‌تواند برای بررسی طیف وسیعی از تغییرات ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرد.

البته حجم داده و پیچیدگی تحلیل در این روش نیز بیشتر است.

RNA Sequencing یا RNA-seq

NGS فقط برای بررسی DNA استفاده نمی‌شود. با استفاده از RNA Sequencing می‌توان RNAهای موجود در یک نمونه را بررسی کرد.

RNA-seq در مطالعه بیان ژن، شناسایی Transcription، بررسی Isoformها و مطالعات ترنسکریپتوم کاربرد دارد.

کاربردهای تکنیک NGS

این تکنیک در سال‌های اخیر کاربردهای بسیار گسترده‌ای پیدا کرده است.

۱. تشخیص بیماری‌های ژنتیکی

یکی از مهم‌ترین کاربردهای ان جی اس، بررسی بیماری‌های ژنتیکی است. با استفاده از پنل‌های ژنی، WES یا WGS می‌توان تغییرات ژنتیکی مرتبط با برخی بیماری‌ها را شناسایی کرد.

تکننیک ان جی اس به‌ویژه زمانی اهمیت پیدا می‌کند که بیماری دارای ناهمگونی ژنتیکی باشد و چندین ژن مختلف بتوانند در ایجاد آن نقش داشته باشند.

۲. NGS در تحقیقات سرطان

در سرطان، تغییرات DNA و RNA سلول‌های توموری می‌توانند اطلاعات مهمی درباره ویژگی‌های تومور ارائه دهند.

با استفاده از ان جی اس می‌توان برخی انواع:

• SNV
• Insertion و Deletion
• Copy Number Variation
• برخی Rearrangementها
• تغییرات مرتبط با ژن‌های سرطان

را بررسی کرد.

این اطلاعات می‌توانند در تحقیقات سرطان و در برخی شرایط در انتخاب روش درمانی هدفمند مورد استفاده قرار گیرند.

۳. پزشکی شخصی

یکی از اهداف مهم ژنومیک مدرن، حرکت از درمان یکسان برای همه بیماران به سمت Personalized Medicine یا پزشکی شخصی است.

اطلاعات ژنتیکی می‌تواند در کنار سایر اطلاعات بالینی به شناسایی تفاوت‌های زیستی میان افراد کمک کند.

۴. مطالعات ژنوم

تکنیک ان جی اس امکان مطالعه ساختار و تنوع ژنتیکی جمعیت‌ها را فراهم کرده است. پژوهشگران می‌توانند با استفاده از WGS، WES و روش‌های هدفمند، تنوع ژنتیکی و واریانت‌های موجود در جمعیت‌های مختلف را بررسی کنند.

۵. مطالعات ترنسکریپتوم

RNA-seq یکی از کاربردهای مهم ان جی اس برای بررسی الگوی بیان ژن‌هاست.

برای مثال، پژوهشگر می‌تواند بیان ژن‌ها را در دو گروه سلولی سالم و بیمار مقایسه کند و ژن‌هایی را که میزان بیان متفاوتی دارند شناسایی کند.

۶. شناسایی میکروارگانیسم‌ها

توالی‌یابی نسل جدید در مطالعات میکروبیولوژی نیز کاربرد دارد. بررسی توالی‌های ژنتیکی میکروارگانیسم‌ها می‌تواند برای شناسایی و مطالعه جوامع میکروبی مورد استفاده قرار گیرد.

روش‌هایی مانند 16S rRNA Sequencing نیز در بررسی ترکیب جوامع باکتریایی کاربرد دارند.

مزایای NGS چیست؟

استفاده از ان جی اس مزایای مهمی نسبت به بسیاری از روش‌های سنتی دارد.

ظرفیت بالا:

تعداد بسیار زیادی از قطعات DNA می‌توانند به‌صورت موازی بررسی شوند.

تولید حجم زیادی از اطلاعات:

ان جی اس امکان بررسی هم‌زمان تعداد زیادی ژن یا حتی کل ژنوم را فراهم می‌کند.

قابلیت Multiplexing:

با استفاده از Index یا Barcode می‌توان چندین نمونه را در یک Run مورد بررسی قرار داد.

کاربردهای متنوع:

از تشخیص و تحقیقات بیماری‌های ژنتیکی گرفته تا سرطان، RNA-seq، میکروبیوم و تحقیقات پایه.

قابلیت شناسایی انواع مختلف تغییرات ژنتیکی:

بسته به طراحی آزمایش و نوع پلتفرم، NGS می‌تواند برای شناسایی انواع مختلف Variantها استفاده شود.

محدودیت‌های NGS

با وجود مزایای فراوان، این تکنیک محدودیت‌هایی نیز دارد.

حجم بالای داده

یک Run NGS می‌تواند حجم بسیار زیادی داده تولید کند و پردازش و ذخیره‌سازی آن به زیرساخت مناسب نیاز دارد.

نیاز به تحلیل بیوانفورماتیکی

تفسیر داده‌های ان جی اس معمولاً نیازمند نرم‌افزارها، Pipelineهای تخصصی و دانش بیوانفورماتیک است.

احتمال ایجاد خطا

مانند هر تکنیک آزمایشگاهی، ان جی اس نیز می‌تواند با خطاهای فنی همراه باشد. کیفیت نمونه، آماده‌سازی Library، کیفیت Sequencing و Pipeline تحلیل همگی می‌توانند بر نتیجه تأثیر بگذارند.

هزینه تجهیزات و زیرساخت

راه‌اندازی یک آزمایشگاه ان جی اس نیازمند تجهیزات، مواد مصرفی، زیرساخت محاسباتی و نیروی متخصص است.

Quality Control در NGS چرا اهمیت دارد؟

کنترل کیفیت در تمام مراحل یک پروژه ان جی اس اهمیت دارد.

کیفیت DNA یا RNA، مقدار ماده اولیه، کیفیت Library، میزان آلودگی، تعداد Reads، کیفیت بازها و درصد Alignment از جمله مواردی هستند که می‌توانند برای ارزیابی کیفیت یک پروژه بررسی شوند.

یکی از شاخص‌های رایج در بررسی کیفیت داده‌های Sequencing، Phred Quality Score است. این امتیاز نشان‌دهنده احتمال خطا در تعیین یک باز است و هرچه مقدار آن بالاتر باشد، نشان‌دهنده کیفیت بهتر داده خواهد بود.

Coverage و Depth در NGS چیست؟

دو مفهوم بسیار مهم در تحلیل داده‌های NGS، Coverage و Depth هستند.

Depth of Coverage به تعداد دفعاتی اشاره دارد که یک موقعیت ژنومی توسط Reads پوشش داده شده است.

برای مثال، اگر یک موقعیت ژنومی توسط 100 Read پوشش داده شود، Depth آن موقعیت برابر 100X خواهد بود.

افزایش Depth می‌تواند احتمال شناسایی برخی Variantها را افزایش دهد؛ با این حال مقدار مناسب Coverage به نوع آزمایش و هدف پروژه بستگی دارد.

Paired-End و Single-End در NGS

در Sequencing می‌توان Reads را به شکل Single-End یا Paired-End تولید کرد.

در Single-End Sequencing هر قطعه از یک طرف خوانده می‌شود.

در Paired-End Sequencing هر قطعه از دو طرف توالی‌یابی می‌شود. این روش می‌تواند اطلاعات بیشتری درباره موقعیت و ساختار قطعات در اختیار قرار دهد و در بسیاری از پروژه‌ها به بهبود تحلیل کمک کند.

خروجی NGS چیست؟

دستگاه‌های ان جی اس معمولاً داده‌های خام توالی‌یابی را در قالب فایل‌هایی مانند FASTQ تولید می‌کنند.

هر Read در FASTQ معمولاً شامل توالی نوکلئوتیدی و اطلاعات مربوط به کیفیت بازهای آن است.

پس از پردازش، بسته به نوع پروژه ممکن است فایل‌ها و خروجی‌هایی مانند BAM، VCF و فایل‌های Annotation تولید شوند.

برای مثال، فایل VCF معمولاً برای ذخیره اطلاعات Variantهای شناسایی‌شده استفاده می‌شود.

NGS چه تفاوتی با PCR دارد؟

PCR و NGS دو تکنیک متفاوت هستند، اما می‌توانند در یک پروژه در کنار یکدیگر استفاده شوند.

PCR عمدتاً برای تکثیر یک ناحیه مشخص از DNA به کار می‌رود، در حالی که ان جی اس برای تولید و تحلیل حجم بسیار زیادی از اطلاعات توالی استفاده می‌شود.

در برخی Workflowهای ان جی اس، PCR یکی از مراحل آماده‌سازی Library است.

بنابراین نمی‌توانان جی اس را صرفاً نسخه پیشرفته PCR دانست؛ این دو فناوری اهداف و کاربردهای متفاوتی دارند.

آینده تکنیک NGS

با پیشرفت فناوری‌های توالی‌یابی، هزینه Sequencing کاهش یافته و سرعت و ظرفیت تولید داده افزایش پیدا کرده است.

هم‌زمان، توسعه روش‌های Long-Read Sequencing، ابزارهای جدید بیوانفورماتیک و روش‌های تحلیل داده با کمک هوش مصنوعی، چشم‌اندازهای جدیدی را در ژنومیک ایجاد کرده‌اند.

ترکیب ان جی اس با فناوری‌هایی مانند Single-Cell Sequencing، Spatial Transcriptomics و Multi-Omics نیز امکان بررسی دقیق‌تر سیستم‌های زیستی را فراهم کرده است.

به همین دلیل، آشنایی با اصول ان جی اس برای دانشجویان و فعالان حوزه‌های ژنتیک، زیست‌شناسی سلولی و مولکولی، بیوتکنولوژی، پزشکی، علوم آزمایشگاهی و بیوانفورماتیک اهمیت زیادی دارد.

جمع‌بندی

تکنیک ان جی اس یا توالی‌یابی نسل جدید یکی از مهم‌ترین فناوری‌های ژنومیک مدرن است که امکان بررسی هم‌زمان تعداد بسیار زیادی از توالی‌های DNA یا RNA را فراهم می‌کند.

فرآیند کلی این تکنیک شامل استخراج ماده ژنتیکی، آماده‌سازی Library، Sequencing، کنترل کیفیت و تحلیل بیوانفورماتیکی است. بسته به هدف پروژه می‌توان از روش‌هایی مانند Targeted Sequencing، WES، WGS و RNA-seq استفاده کرد.

امروزه NGS در زمینه‌هایی مانند تشخیص بیماری‌های ژنتیکی، تحقیقات سرطان، پزشکی شخصی، ژنومیک، ترنسکریپتومیکس و مطالعات میکروبی کاربرد گسترده‌ای دارد و انتظار می‌رود با پیشرفت فناوری‌های توالی‌یابی و بیوانفورماتیک، نقش آن در پژوهش و پزشکی بیش از پیش گسترش پیدا کند.

تکنیک PCR

03136698101

09900043193

پیج اینستاگرام زیست فناوری نوین

سوالات متداول

NGS مخفف چیست؟

NGS مخفف Next-Generation Sequencing و به معنای توالی‌یابی نسل جدید است.

آیا NGS فقط برای DNA استفاده می‌شود؟

خیر. با روش‌هایی مانند RNA-seq می‌توان از فناوری‌های NGS برای مطالعه RNA و ترنسکریپتوم نیز استفاده کرد.

مهم‌ترین کاربرد NGS چیست؟

تشخیص و تحقیقات بیماری‌های ژنتیکی، تحقیقات سرطان، ژنومیک و مطالعات بیان ژن از مهم‌ترین کاربردهای آن هستند.

WES و WGS چه تفاوتی دارند؟

WES عمدتاً نواحی کدکننده ژنوم یعنی اگزوم را بررسی می‌کند، در حالی که WGS برای بررسی تقریباً کل ژنوم طراحی شده است.

آیا NGS جایگزین PCR است؟

خیر. PCR و NGS اهداف متفاوتی دارند و حتی ممکن است PCR به‌عنوان بخشی از فرآیند آماده‌سازی نمونه برای NGS مورد استفاده قرار گیرد.

آیا یادگیری NGS به دانش بیوانفورماتیک نیاز دارد؟

برای انجام و به‌خصوص تحلیل حرفه‌ای پروژه‌های NGS، آشنایی با اصول بیوانفورماتیک بسیار مفید و در بسیاری از پروژه‌ها ضروری است.