اگزوزوم‌ها چیستند و چرا جداسازی اگزوزوم ها اهمیت دارد؟

اگزوزوم‌ها (Exosomes) وزیکول‌های خارج‌سلولی بسیار کوچکی هستند که در فرایندهای ارتباط بین سلولی نقش دارند. این ساختارهای غشادار می‌توانند مولکول‌های زیستی مختلفی از جمله پروتئین‌ها، لیپیدها و انواع RNA را حمل کنند و در انتقال پیام‌های مولکولی میان سلول‌ها نقش داشته باشند.

اگزوزوم‌ها در سال‌های اخیر به یکی از موضوعات مهم پژوهش در زیست‌شناسی سلولی و مولکولی تبدیل شده‌اند. بررسی محتوای مولکولی آن‌ها می‌تواند به شناخت بهتر فرایندهای سلولی، مطالعه بیماری‌ها، شناسایی نشانگرهای زیستی (Biomarkers) و توسعه روش‌های نوین تشخیصی کمک کند.

بااین‌حال، مطالعه دقیق این وزیکول‌ها به جداسازی مناسب آن‌ها از محیط‌های زیستی پیچیده نیاز دارد. در نمونه‌هایی مانند خون، ادرار، بزاق و محیط کشت سلولی، اگزوزوم‌ها در کنار پروتئین‌های محلول، لیپوپروتئین‌ها، ذرات دیگر و سایر اجزای زیستی حضور دارند. بنابراین، انتخاب روش مناسب برای جداسازی اگزوزوم‌ها تأثیر مستقیمی بر کیفیت نمونه و اعتبار نتایج پژوهش دارد.

جداسازی اگزوزوم (Exosome Isolation) به مجموعه روش‌هایی گفته می‌شود که با هدف به‌دست‌آوردن وزیکول‌های موردنظر از یک نمونه زیستی و کاهش آلودگی‌های همراه انجام می‌شوند. انتخاب روش جداسازی به نوع نمونه، هدف آزمایش، تجهیزات موجود و میزان خلوص موردنیاز بستگی دارد.

اگزوزوم‌ها چه تفاوتی با وزیکول‌های خارج‌سلولی دارند؟

وزیکول‌های خارج‌سلولی (Extracellular Vesicles یا EVs) اصطلاحی کلی برای ذرات غشاداری هستند که به‌وسیله سلول‌ها آزاد می‌شوند. اگزوزوم‌ها یکی از زیرگروه‌های این وزیکول‌ها محسوب می‌شوند که منشأ زیستی مشخصی دارند و از مسیر اندوزومی سلول تشکیل می‌شوند.

در بسیاری از مطالعات، وزیکول‌های کوچک خارج‌سلولی (Small Extracellular Vesicles یا sEVs) بررسی می‌شوند. ازآنجاکه اندازه و ویژگی‌های فیزیکی وزیکول‌های مختلف هم‌پوشانی دارند، نمی‌توان صرفاً با استفاده از اندازه یا یک روش جداسازی، منشأ اگزوزومی تمام ذرات به‌دست‌آمده را تأیید کرد.
به همین دلیل، راهنمای علمی MISEV2023 توصیه می‌کند اصطلاحات پژوهشی با توجه به شواهد موجود انتخاب شوند. اگر منشأ اگزوزومی ذرات به‌طور کافی اثبات نشده باشد، استفاده از اصطلاح «وزیکول‌های خارج‌سلولی» یا «وزیکول‌های کوچک خارج‌سلولی» معمولاً دقیق‌تر است.

مهم‌ترین روش‌های جداسازی اگزوزوم ها

روش‌های مختلفی برای جداسازی و تغلیظ اگزوزوم ها توسعه یافته‌اند. هر روش بر ویژگی‌هایی مانند اندازه، چگالی، رفتار ذرات در میدان گریز از مرکز یا اتصال اختصاصی به مولکول‌های سطحی تکیه دارد. هیچ روش واحدی برای تمام نمونه‌ها و اهداف پژوهشی بهترین گزینه نیست.

۱. اولتراسانتریفیوژ (Ultracentrifugation)

اولتراسانتریفیوژ یکی از روش‌های پرکاربرد در مطالعات وزیکول‌های خارج‌سلولی و جداسازی اگزوزوم است. در این روش، نمونه با استفاده از نیروی گریز از مرکز بالا و بر اساس ویژگی‌هایی مانند اندازه، چگالی و سرعت رسوب‌گذاری اجزا تفکیک می‌شود.
در اولتراسانتریفیوژ تفاضلی (Differential Ultracentrifugation)، نمونه معمولاً طی چند مرحله و با افزایش نیروی گریز از مرکز پردازش می‌شود تا اجزای بزرگ‌تر و سپس بخش‌هایی از وزیکول‌های کوچک‌تر به‌صورت رسوب جمع‌آوری شوند.

مزایا:

• کاربرد گسترده در پژوهش‌های آزمایشگاهی
• امکان پردازش نمونه‌های نسبتاً حجیم با تجهیزات مناسب
• قابلیت ترکیب با روش‌های تکمیلی برای بهبود خلوص

محدودیت‌ها:

• نیاز به دستگاه اولتراسانتریفیوژ و روتور مناسب
• زمان‌بر بودن فرایند
• احتمال هم‌رسوبی پروتئین‌ها و سایر ذرات
• احتمال تجمع یا تغییر ویژگی‌های برخی وزیکول‌ها در شرایط نامناسب

نکته مهم این است که اولتراسانتریفیوژ به‌تنهایی جداسازی کاملاً اختصاصی اگزوزوم‌ها را تضمین نمی‌کند.

۲. کروماتوگرافی بر اساس اندازه (Size-Exclusion Chromatography یا SEC)

در کروماتوگرافی بر اساس اندازه، نمونه از ستونی حاوی یک ماتریس متخلخل عبور می‌کند. ذرات بر اساس توانایی ورود به منافذ این ماتریس از یکدیگر تفکیک می‌شوند. ذرات بزرگ‌تر معمولاً زودتر از ستون خارج می‌شوند، درحالی‌که مولکول‌های کوچک‌تر به دلیل ورود به منافذ، دیرتر خارج می‌شوند.
این روش برای جداسازی وزیکول‌های خارج‌سلولی از بخش قابل‌توجهی از پروتئین‌های محلول و برخی اجزای کوچک‌تر نمونه کاربرد دارد.

مزایا:

• جداسازی مناسب بر اساس اندازه
• امکان حفظ بهتر ساختار وزیکول‌ها در مقایسه با برخی فرایندهای سخت
• قابلیت استفاده به‌عنوان مرحله تکمیلی پس از تغلیظ نمونه

محدودیت‌ها:

• احتمال باقی‌ماندن برخی آلودگی‌ها با اندازه مشابه وزیکول‌ها
• نیاز به جمع‌آوری و بررسی فراکسیون‌های مناسب
• محدودیت حجم نمونه قابل بارگذاری در ستون

SEC در بسیاری از مطالعاتی که کاهش آلودگی پروتئینی اهمیت دارد، گزینه مناسبی است؛ اما به‌تنهایی خلوص کامل یا منشأ اگزوزومی ذرات را تضمین نمی‌کند.

۳. رسوب‌دهی پلیمری (Polymer-Based Precipitation)

در این روش از پلیمرهایی مانند پلی‌اتیلن گلیکول (PEG) برای تسهیل رسوب‌گذاری ذرات و افزایش غلظت آن‌ها در نمونه استفاده می‌شود. برخی کیت‌های تجاری جداسازی اگزوزوم نیز از اصول مشابه بهره می‌برند.

مزایا:

• سهولت نسبی اجرا
• نیاز کمتر به تجهیزات تخصصی در برخی پروتکل‌ها
• امکان بازیابی تعداد زیادی ذره از حجم محدود نمونه

محدودیت‌ها:

• احتمال هم‌رسوبی پروتئین‌ها و سایر ذرات غیرهدف
• احتمال باقی‌ماندن مواد پلیمری در نمونه نهایی
• امکان تأثیرگذاری بر نتایج آزمون‌های مولکولی و عملکردی بعدی

نکته مهم این است که افزایش تعداد ذرات بازیابی‌شده لزوماً به معنی افزایش خلوص نیست. بنابراین، رسوب حاصل از این روش نباید بدون بررسی‌های تکمیلی به‌عنوان اگزوزوم خالص در نظر گرفته شود.

۴. فیلتراسیون و اولترافیلتراسیون (Filtration and Ultrafiltration)

در روش‌های فیلتراسیون، از غشاهایی با ویژگی‌های مشخص برای تغلیظ یا جداسازی نسبی اجزای نمونه استفاده می‌شود. در اولترافیلتراسیون، غشاها بر اساس ویژگی‌هایی مانند حد برش مولکولی (Molecular Weight Cut-Off) انتخاب می‌شوند.
این روش‌ها می‌توانند برای کاهش حجم نمونه، تغلیظ وزیکول‌های خارج‌سلولی یا آماده‌سازی نمونه برای مراحل بعدی استفاده شوند.

مزایا:

• امکان تغلیظ نمونه در مدت‌زمان نسبتاً کوتاه
• کاربرد در پردازش حجم‌های مختلف نمونه
• قابلیت ترکیب با کروماتوگرافی یا سایر روش‌های جداسازی

محدودیت‌ها:

• احتمال ازدست‌رفتن بخشی از وزیکول‌ها به دلیل اتصال به غشا
• احتمال گرفتگی فیلتر
• وابستگی نتیجه به جنس غشا، اندازه منافذ و شرایط فرایند

فیلتراسیون به‌تنهایی در همه شرایط روش اختصاصی برای خالص‌سازی اگزوزوم‌ها نیست و اغلب به‌عنوان مرحله تغلیظ یا بخشی از یک پروتکل ترکیبی به کار می‌رود.

۵. جداسازی بر اساس گرادیان چگالی (Density Gradient Centrifugation)

در این روش، نمونه در محیطی با گرادیان چگالی قرار می‌گیرد و ذرات با توجه به ویژگی‌های شناوری خود تفکیک می‌شوند. موادی مانند ساکارز یا یدیکسانول (Iodixanol) بسته به پروتکل مورد استفاده قرار می‌گیرند.
جداسازی بر اساس گرادیان چگالی می‌تواند در کاهش برخی آلودگی‌ها و تفکیک بهتر جمعیت‌های وزیکولی مؤثر باشد.

مزایا:

• امکان افزایش خلوص نمونه در مقایسه با برخی روش‌های ساده‌تر
• کاربرد در مطالعاتی که ویژگی‌های فیزیکی وزیکول‌ها اهمیت دارد
• قابلیت ترکیب با اولتراسانتریفیوژ تفاضلی

محدودیت‌ها:

• پیچیدگی بیشتر مراحل آماده‌سازی
• نیاز به زمان و تجهیزات تخصصی
• احتمال کاهش میزان بازیابی نمونه
• ضرورت جمع‌آوری و ارزیابی دقیق فراکسیون‌ها

۶. جداسازی ایمنی‌اختصاصی (Immunoaffinity Isolation)

در روش‌های ایمنی‌اختصاصی، از آنتی‌بادی‌ها یا مولکول‌های اتصال‌دهنده برای شناسایی و جداسازی ذرات دارای نشانگرهای سطحی مشخص استفاده می‌شود. این روش می‌تواند با استفاده از بسترهای مغناطیسی یا سامانه‌های اتصال اختصاصی اجرا شود.

مزایا:

• امکان غنی‌سازی جمعیت‌های خاصی از وزیکول‌ها
• کاربرد در مطالعات نشانگرهای زیستی
• مناسب برای بررسی وزیکول‌های دارای مولکول‌های سطحی هدف

محدودیت‌ها:

• وابستگی به انتخاب نشانگر مناسب
• هزینه نسبتاً بالای برخی معرف‌ها
• احتمال ازدست‌رفتن وزیکول‌هایی که نشانگر هدف را ندارند یا مقدار کمی از آن را بیان می‌کنند

این روش بیشتر برای جداسازی جمعیت‌های هدفمند مناسب است و نباید به‌عنوان روشی برای بازیابی تمام اگزوزوم‌های موجود در یک نمونه در نظر گرفته شود.

مراحل کلی جداسازی اگزوزوم در آزمایشگاه

پروتکل دقیق جداسازی به نوع نمونه، روش انتخابی و کاربرد نهایی بستگی دارد؛ بااین‌حال، یک فرایند پژوهشی استاندارد معمولاً شامل مراحل زیر است:

مرحله اول: انتخاب و آماده‌سازی نمونه

نمونه می‌تواند از محیط کشت سلولی، پلاسما، سرم، ادرار یا سایر منابع زیستی تهیه شود. شرایط جمع‌آوری، نگهداری و انتقال نمونه باید متناسب با منبع آن تنظیم شود؛ زیرا تأخیر در پردازش، چرخه‌های انجماد و ذوب و آلودگی‌های احتمالی می‌توانند بر نتیجه تأثیر بگذارند.

در نمونه‌های حاصل از کشت سلولی، ترکیبات محیط کشت نیز اهمیت دارند. برای مثال، سرم جنین گاوی (FBS) ممکن است حاوی وزیکول‌های خارج‌سلولی باشد؛ بنابراین، استفاده از شرایط مناسب و کنترل‌های لازم برای کاهش اثر این منبع خارجی ضروری است.

مرحله دوم: حذف سلول‌ها و ذرات بزرگ

بسته به نوع نمونه، ممکن است از مراحل اولیه سانتریفیوژ یا روش‌های مناسب دیگر برای حذف سلول‌های باقی‌مانده، بقایای سلولی و ذرات بزرگ استفاده شود. شرایط این مرحله باید به‌گونه‌ای انتخاب شود که ضمن آماده‌سازی نمونه، جمعیت وزیکولی موردنظر تا حد امکان حفظ شود.

مرحله سوم: تغلیظ یا جداسازی اولیه

در این مرحله از روش‌هایی مانند اولتراسانتریفیوژ، فیلتراسیون، جریان مماسی (Tangential Flow Filtration یا TFF) یا رسوب‌دهی استفاده می‌شود. انتخاب روش به حجم نمونه، تجهیزات موجود و میزان بازیابی موردنیاز بستگی دارد.

مرحله چهارم: خالص‌سازی تکمیلی

اگر کاربرد پژوهش به خلوص بالاتری نیاز داشته باشد، می‌توان از روش‌هایی مانند کروماتوگرافی排 بر اساس اندازه، گرادیان چگالی یا جداسازی ایمنی‌اختصاصی استفاده کرد. ترکیب روش‌ها ممکن است خلوص را افزایش دهد، اما می‌تواند باعث کاهش بازیابی وزیکول‌ها یا افزایش زمان و هزینه فرایند شود.

مرحله پنجم: شناسایی و ارزیابی کیفیت

پس از جداسازی، بررسی ویژگی‌های نمونه ضروری است. صرف مشاهده ذرات یا اندازه‌گیری تعداد آن‌ها برای تأیید هویت اگزوزوم‌ها کافی نیست. ارزیابی مناسب باید متناسب با هدف مطالعه و شامل چند نوع شواهد مستقل باشد.

چگونه کیفیت اگزوزوم‌های جداسازی‌شده را ارزیابی کنیم؟

• ارزیابی کیفیت، بخش مهمی از مطالعات وزیکول‌های خارج‌سلولی است. روش‌های مورد استفاده باید با نوع نمونه، هدف پژوهش و امکانات آزمایشگاه هماهنگ باشند.
• آنالیز ردیابی نانوذرات (Nanoparticle Tracking Analysis یا NTA): برای تخمین توزیع اندازه و غلظت ذرات در سوسپانسیون استفاده می‌شود؛ اما به‌تنهایی نمی‌تواند مشخص کند که همه ذرات اندازه‌گیری‌شده اگزوزوم هستند.
• میکروسکوپ الکترونی (Electron Microscopy): برای بررسی شکل و ویژگی‌های ساختاری ذرات به کار می‌رود. آماده‌سازی نمونه و نوع تصویربرداری بر ظاهر مشاهده‌شده تأثیر می‌گذارند.
• وسترن بلات (Western Blot): برای بررسی پروتئین‌های مرتبط با وزیکول‌های خارج‌سلولی، مانند CD9، CD63، CD81 و برخی پروتئین‌های مرتبط با ساختار و مسیر زیستی آن‌ها استفاده می‌شود. تفسیر نتایج به انتخاب نشانگرها و کنترل آلودگی‌ها وابسته است.
• فلوسایتومتری (Flow Cytometry): بسته به نوع دستگاه و روش آماده‌سازی، می‌تواند برای بررسی نشانگرهای سطحی وزیکول‌ها یا ذرات مناسب به کار رود. محدودیت حساسیت دستگاه برای ذرات بسیار کوچک باید در نظر گرفته شود.
• بررسی آلودگی‌های همراه: سنجش پروتئین‌های غیرهدف یا سایر اجزای احتمالی نمونه می‌تواند به ارزیابی خلوص کمک کند.
  مطابق توصیه‌های MISEV2023، بهتر است شناسایی وزیکول‌ها بر اساس مجموعه‌ای از شواهد مکمل انجام شود و محدودیت هر آزمون در گزارش نتایج مشخص باشد.

کاربردهای جداسازی اگزوزوم در تحقیقات زیستی و پزشکی

۱. شناسایی نشانگرهای زیستی

اگزوزوم‌ها و سایر وزیکول‌های خارج‌سلولی می‌توانند حامل مولکول‌هایی باشند که برای بررسی وضعیت سلول‌ها و تغییرات زیستی اهمیت دارند. مطالعه محتوای RNA و پروتئینی آن‌ها یکی از حوزه‌های پژوهشی در توسعه نشانگرهای زیستی است.

۲. تحقیقات سرطان

بررسی وزیکول‌های خارج‌سلولی در مطالعات سرطان، از جمله پژوهش درباره ارتباط بین سلول‌های توموری و محیط اطراف آن‌ها، مورد توجه قرار گرفته است. تحلیل مولکول‌های موجود در این وزیکول‌ها می‌تواند به شناسایی نشانگرهای بالقوه و بررسی سازوکارهای بیماری کمک کند.
بااین‌حال، بسیاری از کاربردهای تشخیصی مبتنی بر اگزوزوم همچنان در مرحله پژوهش یا اعتبارسنجی قرار دارند و نتایج تحقیقاتی را نباید معادل یک آزمایش تشخیصی تأییدشده در نظر گرفت.

۳. بررسی ارتباط بین سلولی

وزیکول‌های خارج‌سلولی در انتقال مولکول‌های زیستی میان سلول‌ها نقش دارند. جداسازی و تحلیل آن‌ها به پژوهشگران کمک می‌کند مسیرهای پیام‌رسانی، پاسخ‌های سلولی و تعامل میان انواع مختلف سلول را بررسی کنند.

۴. مطالعات بیماری‌های عصبی و متابولیک

در تحقیقات مربوط به بیماری‌های عصبی، اختلالات متابولیک و بیماری‌های التهابی نیز وزیکول‌های خارج‌سلولی مورد مطالعه قرار می‌گیرند. هدف این مطالعات می‌تواند بررسی تغییرات مولکولی، شناسایی نشانگرهای بالقوه یا درک بهتر فرایندهای بیماری باشد.

۵. توسعه سامانه‌های انتقال دارو

توانایی وزیکول‌های خارج‌سلولی در حمل مولکول‌های زیستی، توجه پژوهشگران را به استفاده احتمالی از آن‌ها در سامانه‌های انتقال دارو جلب کرده است. بااین‌حال، تولید استاندارد، کنترل کیفیت، ایمنی، توزیع در بدن و اثربخشی بالینی همچنان از چالش‌های مهم این حوزه هستند.

مزایا و محدودیت‌های روش‌های جداسازی اگزوزوم

انتخاب روش مناسب به ایجاد تعادل میان چند معیار وابسته است: خلوص، میزان بازیابی، حفظ ساختار و عملکرد وزیکول‌ها، هزینه، زمان و قابلیت تکرارپذیری.
روش‌های رسوب‌دهی ممکن است بازیابی بالایی داشته باشند، اما احتمال هم‌رسوبی آلودگی‌ها در آن‌ها مطرح است. کروماتوگرافی بر اساس اندازه می‌تواند بخشی از آلودگی‌های محلول را کاهش دهد، اما لزوماً تمام ذرات غیرهدف را حذف نمی‌کند. اولتراسانتریفیوژ و گرادیان چگالی نیز به تجهیزات مناسب و بهینه‌سازی شرایط نیاز دارند.
به همین دلیل، انتخاب روش نباید فقط بر اساس تعداد ذرات نهایی انجام شود. اگر هدف پژوهش بررسی عملکرد زیستی وزیکول‌ها باشد، حفظ یکپارچگی و فعالیت آن‌ها اهمیت ویژه‌ای دارد؛ درحالی‌که برای برخی مطالعات مولکولی، خلوص و کاهش آلودگی‌های همراه اولویت بالاتری پیدا می‌کند.

جمع‌بندی

جداسازی اگزوزوم یکی از مراحل مهم در پژوهش‌های پیشرفته زیست‌شناسی سلولی و مولکولی است. روش‌هایی مانند اولتراسانتریفیوژ، کروماتوگرافی بر اساس اندازه، رسوب‌دهی پلیمری، فیلتراسیون، گرادیان چگالی و جداسازی ایمنی‌اختصاصی هرکدام مزایا و محدودیت‌های خاص خود را دارند.
انتخاب روش مناسب باید بر اساس منبع نمونه، هدف آزمایش، خلوص موردنیاز و روش‌های ارزیابی کیفیت انجام شود. همچنین، استفاده از آزمون‌های مکمل و گزارش دقیق مراحل جداسازی برای افزایش اعتبار و تکرارپذیری نتایج ضروری است.
آشنایی با اصول جداسازی و ارزیابی وزیکول‌های خارج‌سلولی می‌تواند مسیر انجام پژوهش‌های دقیق‌تر در زمینه زیست‌شناسی مولکولی، نشانگرهای زیستی و فناوری‌های نوین پزشکی را هموار کند.

دوره های آموزشی بیونوین

03136698101

09900043193

پیج اینستاگرام زیست فناوری نوین

پرسش‌های متداول درباره جداسازی اگزوزوم (FAQ)

بهترین روش جداسازی اگزوزوم کدام است؟

روش واحدی که برای همه نمونه‌ها بهترین باشد وجود ندارد. اولتراسانتریفیوژ، کروماتوگرافی排 بر اساس اندازه، گرادیان چگالی و روش‌های ایمنی‌اختصاصی با توجه به هدف پژوهش انتخاب می‌شوند. گاهی ترکیب دو روش می‌تواند خلوص را افزایش دهد.

آیا کیت‌های تجاری جداسازی اگزوزوم قابل اعتماد هستند؟

کیت‌های تجاری می‌توانند کار را ساده‌تر کنند، اما عملکرد آن‌ها به اصل جداسازی، نوع نمونه و کاربرد نهایی وابسته است. برخی کیت‌های رسوب‌دهی، علاوه بر وزیکول‌ها، پروتئین‌ها و سایر ذرات را نیز جمع‌آوری می‌کنند؛ بنابراین، ارزیابی کیفیت محصول نهایی ضروری است.

برای تأیید جداسازی اگزوزوم از چه آزمایش‌هایی استفاده می‌شود؟

بسته به هدف مطالعه می‌توان از NTA برای بررسی اندازه و غلظت ذرات، میکروسکوپ الکترونی برای ارزیابی ساختار، و وسترن بلات یا روش‌های مناسب دیگر برای بررسی نشانگرهای مولکولی استفاده کرد. هیچ‌یک از این آزمون‌ها به‌تنهایی برای اثبات خلوص و هویت تمام ذرات کافی نیست.

آیا اگزوزوم‌ها در تشخیص سرطان کاربرد دارند؟

اگزوزوم‌ها و سایر وزیکول‌های خارج‌سلولی از منابع مورد بررسی برای توسعه نشانگرهای زیستی سرطان هستند. بااین‌حال، کاربرد بالینی هر آزمون باید جداگانه از نظر دقت، اعتبار و تأییدیه‌های مربوط ارزیابی شود.

تفاوت جداسازی و خالص‌سازی اگزوزوم چیست؟

جداسازی به فرایند تفکیک یا بازیابی جمعیت موردنظر از نمونه اشاره دارد؛ درحالی‌که خالص‌سازی بر کاهش آلودگی‌ها و اجزای غیرهدف تمرکز دارد. در بسیاری از پروتکل‌ها، جداسازی و خالص‌سازی در چند مرحله مکمل انجام می‌شوند.