ایمونوهیستوشیمی (IHC)، از شناسایی پروتئین تا تشخیص سرطان
ایمونوهیستوشیمی چیست؟
ایمونوهیستوشیمی (Immunohistochemistry یا IHC) یکی از تکنیک‌های مهم در آزمایشگاه‌های آسیب‌شناسی، زیست‌شناسی سلولی و تحقیقات زیست‌پزشکی است که برای شناسایی و تعیین محل حضور پروتئین‌ها و سایر آنتی‌ژن‌های هدف در سلول‌ها و بافت‌ها استفاده می‌شود. این روش با بهره‌گیری از واکنش اختصاصی آنتی‌بادی و آنتی‌ژن، امکان مشاهده مولکول‌های موردنظر را در ساختار طبیعی بافت فراهم می‌کند.
در بسیاری از آزمایش‌های مولکولی، اطلاعاتی درباره وجود یا مقدار یک مولکول به دست می‌آید؛ اما در ایمونوهیستوشیمی، علاوه بر شناسایی هدف، می‌توان بررسی کرد که این مولکول در کدام سلول‌ها، کدام بخش از بافت و کدام ناحیه سلولی قرار گرفته است. این ویژگی، IHC را به ابزاری ارزشمند برای بررسی تغییرات بافتی و سلولی تبدیل می‌کند.
برای مثال، در بررسی یک نمونه مشکوک به تومور، مشاهده شکل سلول‌ها به‌تنهایی همیشه برای تعیین نوع تومور کافی نیست. در چنین شرایطی، استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی علیه نشانگرهای پروتئینی می‌تواند به آسیب‌شناس در شناسایی منشأ سلولی و طبقه‌بندی دقیق‌تر ضایعه کمک کند.
ایمونوهیستوشیمی هم در تشخیص پزشکی و هم در پژوهش‌های آزمایشگاهی کاربرد دارد و از روش‌های مهم در مطالعه سرطان، بیماری‌های التهابی و اختلالات مرتبط با تغییر بیان پروتئین‌ها محسوب می‌شود.
اصل علمی تکنیک ایمونوهیستوشیمی
اساس تکنیک IHC بر شناسایی اختصاصی آنتی‌ژن توسط آنتی‌بادی استوار است. آنتی‌ژن هدف در این روش معمولاً یک پروتئین بافتی است که آنتی‌بادی می‌تواند بخش مشخصی از آن، موسوم به اپی‌توپ (Epitope)، را شناسایی کند.
پس از اتصال آنتی‌بادی به هدف، از یک سیستم آشکارسازی برای قابل مشاهده کردن این اتصال استفاده می‌شود. در روش‌های رایج رنگ‌آمیزی، این سیستم می‌تواند یک واکنش آنزیمی باشد که محصول رنگی ایجاد می‌کند. در نتیجه، محل حضور آنتی‌ژن در بافت با میکروسکوپ قابل بررسی خواهد بود.
به‌طور کلی، مراحل علمی این فرایند شامل موارد زیر است:
- آماده‌سازی و حفظ ساختار نمونه بافتی
- آماده‌سازی آنتی‌ژن برای شناسایی توسط آنتی‌بادی
- اتصال آنتی‌بادی اختصاصی به هدف
- آشکارسازی واکنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی
- بررسی میکروسکوپی و تفسیر الگوی رنگ‌آمیزی
اختصاصیت آنتی‌بادی، کیفیت آماده‌سازی نمونه و انتخاب صحیح روش آشکارسازی از عوامل مهم در اعتبار نتایج ایمونوهیستوشیمی هستند. همچنین، وجود رنگ‌آمیزی به‌تنهایی اثبات نمی‌کند که سیگنال مشاهده‌شده حتماً ناشی از اتصال اختصاصی به هدف موردنظر است؛ بنابراین، استفاده از کنترل‌های مناسب اهمیت زیادی دارد.
مراحل انجام ایمونوهیستوشیمی در آزمایشگاه
اجرای موفق تکنیک ایمونوهیستوشیمی به رعایت ترتیب مراحل، انتخاب معرف‌های مناسب و کنترل دقیق شرایط آزمایش بستگی دارد. پروتکل دقیق ممکن است با توجه به نوع بافت، آنتی‌ژن هدف، آنتی‌بادی و سیستم آشکارسازی متفاوت باشد.
۱. تثبیت و آماده‌سازی نمونه بافتی
در ابتدای کار، نمونه بافتی باید به شکلی آماده شود که ساختار سلول‌ها و آنتی‌ژن‌های موردنظر تا حد امکان حفظ شوند. تثبیت بافت معمولاً با استفاده از فیکساتیوهایی مانند فرمالین بافرشده انجام می‌شود.
پس از تثبیت، در بسیاری از پروتکل‌ها نمونه در پارافین قالب‌گیری شده و به برش‌های نازک تبدیل می‌شود. این برش‌ها روی لام میکروسکوپی قرار می‌گیرند تا مراحل بعدی رنگ‌آمیزی روی آن‌ها انجام شود.
کیفیت تثبیت و مدت‌زمان آن اهمیت زیادی دارد؛ زیرا تثبیت نامناسب یا بیش‌ازحد می‌تواند دسترسی آنتی‌بادی به اپی‌توپ را تغییر دهد و بر شدت رنگ‌آمیزی اثر بگذارد.
۲. پارافین‌زدایی و آب‌رسانی
در نمونه‌های پارافینی، ابتدا پارافین از بافت حذف می‌شود. سپس نمونه طی مراحل مشخص به محیط آبی منتقل می‌شود تا شرایط مناسب برای واکنش‌های بعدی فراهم شود.
اگر پارافین به‌طور کامل حذف نشود یا مراحل آب‌رسانی به‌درستی انجام نگیرد، ممکن است واکنش آنتی‌بادی با آنتی‌ژن هدف به‌خوبی صورت نگیرد و کیفیت رنگ‌آمیزی کاهش پیدا کند.
۳. بازیابی آنتی‌ژن (Antigen Retrieval)
یکی از مراحل مهم در بسیاری از پروتکل‌های ایمونوهیستوشیمی، بازیابی آنتی‌ژن است. تثبیت بافت، به‌ویژه با فرمالین، می‌تواند با ایجاد اتصالات شیمیایی، دسترسی آنتی‌بادی به برخی اپی‌توپ‌ها را محدود کند.
برای برطرف کردن این مشکل، از روش‌های بازیابی آنتی‌ژن استفاده می‌شود. دو روش متداول عبارت‌اند از:
- بازیابی حرارتی (HIER): استفاده از گرما در بافر مناسب برای افزایش دسترسی به اپی‌توپ‌ها.
- بازیابی آنزیمی: استفاده از آنزیم‌های مناسب برای اصلاح ساختارهای محدودکننده دسترسی به آنتی‌ژن.
انتخاب روش مناسب به ویژگی‌های آنتی‌ژن و آنتی‌بادی وابسته است. بازیابی بیش‌ازحد یا نامناسب نیز ممکن است به بافت آسیب بزند یا رنگ‌آمیزی غیراختصاصی ایجاد کند.
۴. مسدودسازی واکنش‌های غیراختصاصی
در این مرحله تلاش می‌شود اتصال غیراختصاصی آنتی‌بادی‌ها و تداخل عوامل زمینه‌ای کاهش پیدا کند. در برخی روش‌ها، برای مهار فعالیت آنزیم‌های درون‌زاد بافت نیز از مراحل مسدودسازی اختصاصی استفاده می‌شود.
نوع مسدودسازی به سیستم آشکارسازی، نوع نمونه و ویژگی‌های آنتی‌بادی بستگی دارد. اجرای صحیح این مرحله به کاهش رنگ‌آمیزی زمینه‌ای و بهبود وضوح سیگنال کمک می‌کند.
۵. افزودن آنتی‌بادی اولیه
آنتی‌بادی اولیه (Primary Antibody) مستقیماً آنتی‌ژن هدف را شناسایی می‌کند. انتخاب آنتی‌بادی مناسب یکی از حساس‌ترین بخش‌های اجرای IHC است؛ زیرا اختصاصیت، غلظت، زمان انکوباسیون و شرایط واکنش می‌توانند بر نتیجه نهایی اثر بگذارند.
در این مرحله، آنتی‌بادی در شرایط تعیین‌شده توسط پروتکل با نمونه انکوبه می‌شود تا امکان اتصال آن به آنتی‌ژن فراهم شود.
۶. افزودن سیستم آشکارسازی و ایجاد رنگ
پس از اتصال آنتی‌بادی اولیه، سیستم آشکارسازی برای مشاهده واکنش به کار می‌رود. در روش‌های غیرمستقیم، آنتی‌بادی ثانویه می‌تواند به آنتی‌بادی اولیه متصل شود و یک آنزیم یا نشانگر را به محل واکنش هدایت کند.
یکی از سیستم‌های رایج در ایمونوهیستوشیمی کروموژنیک، سیستم HRP/DAB است. در این روش، آنزیم پراکسیداز ترب کوهی (HRP) واکنش ایجاد رنگ را کاتالیز می‌کند و کروموژن DAB معمولاً رسوب قهوه‌ای‌رنگی در محل حضور هدف ایجاد می‌کند.
در روش‌های دیگر، از کروموژن‌ها یا نشانگرهای فلورسنت استفاده می‌شود. پس از تکمیل واکنش، بسته به پروتکل، نمونه شست‌وشو داده شده و ممکن است رنگ‌آمیزی زمینه‌ای، آب‌گیری و نصب لامل انجام شود.
۷. بررسی میکروسکوپی و تفسیر نتایج
در پایان، لام با میکروسکوپ بررسی می‌شود. ارزیابی فقط به مشاهده رنگ محدود نیست؛ بلکه محل رنگ‌آمیزی، شدت سیگنال، درصد سلول‌های مثبت، شکل بافت و وجود رنگ‌آمیزی زمینه‌ای نیز اهمیت دارند.
برای مثال، یک نشانگر ممکن است به‌طور طبیعی در هسته سلول قرار داشته باشد، درحالی‌که نشانگر دیگری عمدتاً در سیتوپلاسم یا غشای سلولی مشاهده شود. بنابراین، تفسیر نتیجه باید با توجه به الگوی مورد انتظار برای نشانگر موردنظر و در صورت استفاده تشخیصی، بر اساس معیارهای معتبر همان آزمون انجام شود.
کاربردهای ایمونوهیستوشیمی در علوم زیستی و پزشکی
تکنیک ایمونوهیستوشیمی به دلیل توانایی شناسایی پروتئین‌ها در بستر بافتی، در حوزه‌های مختلف تحقیقات زیستی و تشخیص آزمایشگاهی استفاده می‌شود. مهم‌ترین کاربردهای این روش عبارت‌اند از:
۱. ایمونوهیستوشیمی در تشخیص و بررسی سرطان
یکی از مهم‌ترین کاربردهای IHC، بررسی تومورها و کمک به تشخیص انواع سرطان است. سلول‌های سرطانی ممکن است الگوی بیان پروتئین متفاوتی نسبت به سلول‌های طبیعی داشته باشند. بررسی این تفاوت‌ها به آسیب‌شناس کمک می‌کند تا اطلاعات بیشتری درباره ماهیت تومور به دست آورد.
برای مثال، در ارزیابی سرطان پستان، نشانگرهایی مانند گیرنده استروژن (ER)، گیرنده پروژسترون (PR) و HER2 برای طبقه‌بندی زیستی تومور و کمک به تصمیم‌گیری درمانی بررسی می‌شوند. شاخص Ki-67 نیز برای ارزیابی تکثیر سلولی کاربرد دارد.
بااین‌حال، نتیجه ایمونوهیستوشیمی باید در کنار ویژگی‌های بافت‌شناسی، اطلاعات بالینی و در صورت لزوم سایر آزمایش‌ها تفسیر شود. این روش به‌تنهایی برای تعیین تمام ویژگی‌های یک تومور کافی نیست.
۲. شناسایی منشأ تومورها و افتراق انواع آن‌ها
گاهی سلول‌های توموری از نظر شکل ظاهری شباهت زیادی به یکدیگر دارند و تشخیص منشأ آن‌ها دشوار است. در این شرایط، استفاده از مجموعه‌ای از نشانگرهای اختصاصی می‌تواند به شناسایی تمایز سلولی و افتراق میان انواع تومورها کمک کند.
برای نمونه، نشانگرهای مرتبط با سلول‌های اپیتلیال، لنفوسیت‌ها یا سلول‌های ملانوسیتی می‌توانند در مسیر بررسی آسیب‌شناختی مفید باشند. انتخاب پنل نشانگرها باید بر اساس تشخیص‌های افتراقی مطرح‌شده و شواهد علمی انجام شود.
۳. بررسی بیماری‌های التهابی و ایمنی
ایمونوهیستوشیمی برای بررسی توزیع سلول‌های ایمنی در بافت‌ها و مطالعه واکنش‌های التهابی نیز استفاده می‌شود. پژوهشگران می‌توانند با کمک آنتی‌بادی‌های اختصاصی، جمعیت‌های سلولی مختلف را شناسایی کنند و تغییرات آن‌ها را در شرایط طبیعی یا بیماری بررسی کنند.
این کاربرد در مطالعات مربوط به بیماری‌های خودایمنی، التهاب مزمن، پاسخ ایمنی به عفونت‌ها و تعامل میان سلول‌های ایمنی و بافت‌های آسیب‌دیده اهمیت دارد.
۴. کاربرد در تحقیقات زیست‌شناسی سلولی و مولکولی
در تحقیقات آزمایشگاهی، ایمونوهیستوشیمی روشی برای مطالعه بیان و توزیع پروتئین‌ها در نمونه‌های بافتی است. برای مثال، پژوهشگر می‌تواند بررسی کند که آیا یک پروتئین خاص در ناحیه مشخصی از بافت افزایش یافته است یا خیر.
همچنین، این تکنیک می‌تواند برای بررسی تغییرات بیان پروتئین پس از تیمار سلولی، مداخله دارویی یا ایجاد مدل‌های بیماری به کار رود؛ البته طراحی مناسب مطالعه و استفاده از روش‌های مکمل برای نتیجه‌گیری معتبر ضروری است.
کنترل کیفیت در ایمونوهیستوشیمی
کنترل کیفیت یکی از مهم‌ترین بخش‌های اجرای تکنیک ایمونوهیستوشیمی است. حتی اگر رنگ‌آمیزی از نظر ظاهری واضح باشد، بدون کنترل‌های مناسب نمی‌توان با اطمینان درباره اختصاصیت واکنش یا اعتبار نتیجه قضاوت کرد.
دو گروه اصلی کنترل در IHC عبارت‌اند از:
- کنترل مثبت (Positive Control): نمونه‌ای که وجود آنتی‌ژن هدف در آن از قبل مشخص است. این کنترل بررسی می‌کند که سیستم آزمایش توانایی آشکارسازی هدف را دارد.
- کنترل منفی (Negative Control): کنترلی مناسب برای ارزیابی احتمال رنگ‌آمیزی غیراختصاصی و تفسیر صحیح سیگنال مشاهده‌شده.
انتخاب کنترل منفی به نوع آزمون و هدف ارزیابی بستگی دارد؛ حذف آنتی‌بادی اولیه به‌تنهایی، اختصاصیت اتصال آن به آنتی‌ژن را اثبات یا رد نمی‌کند. به همین دلیل، اعتبارسنجی آنتی‌بادی و تفسیر کنترل‌ها باید بر اساس دستورالعمل‌های علمی مناسب انجام شود.
مزایا و محدودیت‌های تکنیک ایمونوهیستوشیمی
ایمونوهیستوشیمی مانند سایر روش‌های آزمایشگاهی، مزایا و محدودیت‌های مشخصی دارد. آشنایی با این ویژگی‌ها به انتخاب صحیح روش و تفسیر دقیق‌تر نتایج کمک می‌کند.
مزایای ایمونوهیستوشیمی
- تعیین محل پروتئین‌ها در بافت: امکان مشاهده توزیع آنتی‌ژن در سلول‌ها و بخش‌های مختلف بافت.
- کمک به تشخیص آسیب‌شناختی: فراهم کردن اطلاعات تکمیلی برای بررسی و طبقه‌بندی تومورها و سایر ضایعات.
- قابلیت استفاده از نمونه‌های بافتی: امکان بررسی بسیاری از نمونه‌های تثبیت‌شده و قالب‌گیری‌شده در پارافین.
- امکان بررسی چند نشانگر: استفاده از پنل‌های مختلف نشانگرها برای پاسخ به پرسش‌های تشخیصی یا پژوهشی.
- کاربرد گسترده در تحقیقات: کمک به بررسی تغییرات بیان پروتئین‌ها در شرایط مختلف زیستی.
محدودیت‌های ایمونوهیستوشیمی
- وابستگی به کیفیت آنتی‌بادی: آنتی‌بادی نامناسب یا دارای واکنش متقاطع می‌تواند نتایج گمراه‌کننده ایجاد کند.
- حساسیت به آماده‌سازی نمونه: تثبیت نامناسب، آسیب بافتی و بازیابی ناکافی آنتی‌ژن ممکن است باعث نتایج منفی کاذب شوند.
- احتمال رنگ‌آمیزی غیراختصاصی: اتصال‌های ناخواسته یا فعالیت آنزیم‌های درون‌زاد می‌توانند تفسیر را دشوار کنند.
- نیاز به تفسیر تخصصی: شدت رنگ به‌تنهایی برای نتیجه‌گیری کافی نیست و باید در زمینه بافت‌شناسی و معیارهای معتبر بررسی شود.
- محدودیت در اندازه‌گیری کمی: رنگ‌آمیزی معمولی IHC همیشه معادل اندازه‌گیری دقیق مقدار مطلق پروتئین نیست.
تفاوت ایمونوهیستوشیمی (IHC) و ایمونوفلورسانس (IF)
هر دو تکنیک ایمونوهیستوشیمی و ایمونوفلورسانس برای شناسایی اهداف زیستی با کمک آنتی‌بادی استفاده می‌شوند؛ اما سیستم آشکارسازی آن‌ها متفاوت است.
| ویژگی | ایمونوهیستوشیمی (IHC) | ایمونوفلورسانس (IF) |
| روش آشکارسازی | معمولاً واکنش آنزیمی و ایجاد رنگ | استفاده از نشانگرهای فلورسنت |
| تجهیزات مشاهده | معمولاً میکروسکوپ نوری | میکروسکوپ فلورسنت |
| بررسی بافت | حفظ معماری بافت در بسیاری از پروتکل‌ها | امکان بررسی ساختار بافت و محل نشانگرهای فلورسنت |
| بررسی چند هدف | بسته به روش و سیستم رنگ‌آمیزی | امکان بررسی چند نشانگر با رنگ‌های فلورسنت متفاوت |
| ملاحظات فنی | کنترل رنگ زمینه و واکنش‌های غیراختصاصی | کنترل خودفلورسانسی، تداخل طیفی و افت سیگنال نوری |
انتخاب میان این دو روش به هدف مطالعه، نوع نمونه، امکانات آزمایشگاه و ویژگی‌های آنتی‌بادی‌ها بستگی دارد. هیچ‌یک در تمام کاربردها بر دیگری برتری مطلق ندارد.
تفاوت ایمونوهیستوشیمی و ایمونوسیتوشیمی
ایمونوهیستوشیمی و ایمونوسیتوشیمی (Immunocytochemistry یا ICC) از نظر اصل شناسایی آنتی‌ژن توسط آنتی‌بادی مشابه‌اند؛ اما نوع نمونه مورد بررسی در آن‌ها متفاوت است.
در ایمونوهیستوشیمی، تمرکز اصلی بر شناسایی اهداف در برش‌های بافتی و بررسی آن‌ها در ارتباط با معماری بافت است. در ایمونوسیتوشیمی، معمولاً سلول‌های منفرد یا مجموعه‌ای از سلول‌ها که روی سطح مناسب تثبیت شده‌اند، بررسی می‌شوند.
برای مثال، بررسی یک نشانگر پروتئینی در برش بافت توموری می‌تواند با IHC انجام شود، درحالی‌که بررسی همان نشانگر در سلول‌های کشت‌شده ممکن است با ICC صورت بگیرد. البته انتخاب روش به نوع نمونه و هدف آزمایش بستگی دارد و مرزبندی کاربرد این دو تکنیک در برخی پروتکل‌ها می‌تواند هم‌پوشانی داشته باشد.
چه عواملی بر کیفیت نتایج IHC تأثیر می‌گذارند؟
برای دستیابی به نتایج قابل اعتماد، باید چند عامل مهم در طراحی و اجرای آزمایش کنترل شوند:
- نوع و کیفیت نمونه: نمونه باید به‌درستی جمع‌آوری، تثبیت و نگهداری شود.
- انتخاب آنتی‌بادی مناسب: اختصاصیت آنتی‌بادی باید برای کاربرد موردنظر بررسی و اعتبارسنجی شود.
- بهینه‌سازی پروتکل: شرایط بازیابی آنتی‌ژن، غلظت آنتی‌بادی، زمان انکوباسیون و روش آشکارسازی باید متناسب با آزمون باشند.
- کنترل‌های معتبر: کنترل مثبت و منفی مناسب باید برای ارزیابی اعتبار رنگ‌آمیزی استفاده شوند.
- تفسیر اصولی: الگوی رنگ‌آمیزی باید در کنار مورفولوژی بافت و اطلاعات مرتبط بررسی شود.
رعایت این اصول، احتمال بروز خطاهای فنی را کاهش می‌دهد و به تکرارپذیری بهتر نتایج در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و تشخیصی کمک می‌کند.
جمع‌بندی
ایمونوهیستوشیمی (IHC) یکی از تکنیک‌های پرکاربرد در آزمایشگاه‌های آسیب‌شناسی و تحقیقات زیست‌پزشکی است که با استفاده از واکنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی، امکان شناسایی پروتئین‌های هدف را در بستر بافتی فراهم می‌کند. از بررسی نشانگرهای سرطان پستان گرفته تا مطالعه سلول‌های ایمنی و تغییرات بیان پروتئین‌ها، این روش اطلاعات ارزشمندی درباره ویژگی‌های سلولی و بافتی ارائه می‌دهد.
بااین‌حال، دستیابی به نتایج معتبر مستلزم آماده‌سازی صحیح نمونه، انتخاب آنتی‌بادی مناسب، بهینه‌سازی مراحل رنگ‌آمیزی، استفاده از کنترل‌های معتبر و تفسیر تخصصی است. یادگیری اصول و مراحل اجرای ایمونوهیستوشیمی می‌تواند برای دانشجویان زیست‌شناسی، علوم آزمایشگاهی، بیوتکنولوژی و پژوهشگران حوزه پزشکی مولکولی بسیار مفید باشد.
در بیونوین، آشنایی با تکنیک‌های آزمایشگاهی و اصول اجرای روش‌های تحقیقاتی می‌تواند به دانشجویان کمک کند تا درک دقیق‌تری از کاربرد ابزارهای تشخیصی و پژوهشی در علوم زیستی به دست آورند.
دوره های آموزشی بیونوین
سؤالات متداول
ایمونوهیستوشیمی برای چه کاری استفاده می‌شود؟
ایمونوهیستوشیمی برای شناسایی و تعیین محل پروتئین‌ها و آنتی‌ژن‌های هدف در بافت‌ها استفاده می‌شود. این تکنیک در آسیب‌شناسی، بررسی تومورها، تحقیقات سرطان و مطالعات زیست‌شناسی سلولی کاربرد دارد.
آیا ایمونوهیستوشیمی فقط برای تشخیص سرطان است؟
خیر. اگرچه IHC در تشخیص و طبقه‌بندی بسیاری از تومورها اهمیت زیادی دارد، کاربرد آن به سرطان محدود نیست و در بررسی بیماری‌های التهابی، مطالعات ایمنی‌شناسی و تحقیقات پایه نیز استفاده می‌شود.
چرا بازیابی آنتی‌ژن در IHC اهمیت دارد؟
بازیابی آنتی‌ژن به دسترسی بهتر آنتی‌بادی به اپی‌توپ‌هایی کمک می‌کند که ممکن است در جریان تثبیت بافت پنهان یا کمتر قابل دسترس شده باشند. انتخاب روش مناسب می‌تواند حساسیت رنگ‌آمیزی را بهبود دهد.
آیا نتیجه مثبت ایمونوهیستوشیمی به معنی وجود قطعی بیماری است؟
خیر. نتیجه مثبت باید با توجه به نوع نشانگر، محل و الگوی رنگ‌آمیزی، کیفیت کنترل‌ها و زمینه بالینی یا پژوهشی تفسیر شود. نتیجه IHC به‌تنهایی همیشه برای تشخیص قطعی یک بیماری کافی نیست.
آیا ایمونوهیستوشیمی یک روش کمی است؟
ایمونوهیستوشیمی در درجه اول امکان شناسایی و تعیین محل آنتی‌ژن را فراهم می‌کند. شدت و درصد رنگ‌آمیزی را می‌توان با روش‌های استاندارد ارزیابی کرد، اما اندازه‌گیری کمی معتبر به پروتکل بهینه‌شده، معیارهای امتیازدهی و در صورت نیاز تحلیل تصویر وابسته است.